哺乳动物细胞蛋白表达FAQ

1、什么是质粒超螺旋，超螺旋对提高表达量有什么帮助？

答：闭环DNA（closed circular DNA）没有断口的双链环状DNA，亦称为超螺旋DNA ，超螺旋比例90%以上是比较理想的真核表达质粒，较低的超螺旋比例会降低表达量近50%以上。

2、CHO细胞与293细胞有什么区别？

答：CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞，是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一。该细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，自身很少分泌内源蛋白，因此有利于目的蛋白的纯化分离；相较于其他细胞类型，CHO细胞是治疗性蛋白生产的主要宿主细胞的原因如下：
（1）能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长，
（2）该细胞基因组信息明确，在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性，
（3）能够表达与人相似的翻译后修饰。
此外，CHO细胞表达系统的最重要优势之一是能够容易的得到基因改造的细胞。然而，因为糖基化模式与人类不完全相同，导致CHO细胞产生的重组蛋白在某些时候仍然表现出免疫原性。
HEK293细胞是真核蛋白表达常用的细胞之一，它具有以下优势： 更快的生长速度，更高的生长密度、转染效率高，表达后修饰更接近人体蛋白的结构，可能会有潜在的人病毒污染。

3、常用的哺乳动物细胞蛋白表达系统是什么？原理是什么？

答：我们常用的系统是2936e细胞配套PTT5(pAZ5)载体 HEK2936E 是在细胞的基因组中整合了EBV病毒的 nuclear antigen 1 (EBNA1),该蛋白可以保证含有EBV病毒复制原点(EBV ori）的质粒在HEK293E细胞株中复制，提高质粒的拷贝数，进而提高克隆在此种质粒上的外源基因的表达水平。 该系统比常规的293F细胞表达量要高。

4、导致哺乳动物细胞蛋白表达低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？

答：基因是否优化，有的蛋白稀有密码子较多，需要对应表达细胞进行优化密码子。
蛋白本身就比较难做，比如细胞因子类的，衣壳蛋白类的，膜蛋白。
质粒质量：内毒素水平、有无蛋白和核酸污染、超螺旋比例、无盐苯酚等试剂
分子量较大或者太小：大于150KD表达会有一定的难度，小于5KD也会有难度。
有的表达量不低，但是纯化得率低（可溶性差，不挂住，不稳定，易降解）
难表达蛋白：细胞因子、激素、抗菌肽、衣壳蛋白、膜蛋白

5、促进蛋白表达的方式有哪些？

答： 加可溶性标签GST,FC、加促表达标签GST、加表达量高的融合蛋白这些都是设计
选用高表达系统：比如293细胞较cho细胞转染效率要高，EXPI293或者Expicho系统表达较freestyle系统表达水平高，但是成本也较高。
表达优化：细胞系、质粒、转染试剂方面的实验优化
工艺优化：加辅料、低温、加葡糖糖、二次转染等方式提高表达量，延长表达时间。

6、是不是都能实现分泌表达？

信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电 信号肽的N末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列．以中性氨基酸为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点．也称加工区。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔．而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。
信号肽只是一个搬运工具，它能够促进蛋白搬运到胞外区，有的蛋白胞内的组织蛋白或者结构蛋白等分泌能力较弱的蛋白可能就不能被信号肽酶切除。

7、哺乳动物细胞蛋白表达体系可表达的蛋白大小范围？

10kd-120kd。
分子量大于150KD，小于5KD表达是有难度的，但是昆虫系统对大分子蛋白表达是有优势的，目前我们接触过250KD的蛋白用昆虫杆状病毒表达系统表达成功。

8、什么情况下需要选择哺乳动物细胞蛋白表达体系来表达？

答：生物药蛋白、分泌蛋白、糖基化修饰高的蛋白、需要活性蛋白、内毒素要求控制的蛋白 亚细胞定位在胞外的蛋白。以上说明不代表昆虫不能做

9、表达得到的蛋白是有活性的么？

答：哺乳动物细胞蛋白表达系统表达的蛋白基本上有活性，但是蛋白不一样很多蛋白没有活性可能是蛋白本身原因，比如亲水性差，可溶性差，不稳定等。

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